星形胶质细胞条件培养液对缺氧/复氧损伤神经元的保护作用及其机制探讨

【摘要】背景随着人们物质生活的改善，老年人口逐年增加，神经系统疾病的发病率逐年上升，其中脑血管疾病是现在神经内科最常见的一种疾病，它已成为我国致残和致死性疾病病因的第一位，而且呈逐年上升趋势，在脑血管疾病中缺血性卒中又占全部脑血管疾病的80%~85%。由于成年人中罹患缺血性卒中人数迅速增加，由此不仅降低了人们的生活质量，同时也给患者家庭和社会带来了巨大的负担，因此，寻找治疗缺血性卒中的新方法势在必行。目前，尚无一种对所有缺血性卒中有确切疗效的治疗方法。在短暂性脑缺血发作的研究过程中，发现了脑组织存在着缺血预处理；但是缺血预处理在临床中无法被复制，然而它又是目前发现的一种对缺血缺氧性脑病有确切疗效的治疗方法；学者们为了解决缺血对脑组织造成的严重损伤，提出使用药物进行预处理设想，利用药物代替或激发体内的内源性物质，如腺苷（adenosine，Ado）、缓激肽和一氧化氮（nitricoxide，NO）等的作用，而起到缺血预处理的效能，对中枢神经系统发挥保护作用。Ado及其受体在多种脏器缺血再灌注的损伤方面有重要的保护作用。一般情况下，30~300nmol/L是脑细胞外液Ado的正常水平，脑缺血缺氧等病理状态下Ado在细胞外液的水平可达到5~40umol/L，甚至可达正常的200多倍。通过此结论得出，内源性的神经保护因子的应激反应可能是通过急剧增加Ado水平实现的。星形胶质细胞（astrocyte，AS）主要存在于中枢神经系统中，它支持及对神经元起着营养作用。当星形胶质细胞激活后产生了数量大、种类多的神经递质，细胞因子（L-6），神经营养因子（BDNF）等；当机体遇到组织缺血等病理状态下时，AS会分泌大量的神经营养因子，如：脑源性BDNF、神经生长因子（NGF）、血管内皮生长因子（VEGF）及L-6等；这些BDNF大量地出现，能对受损的神经元起到一定的保护作用并能够加速病损神经元的功能恢复。大量的体外细胞培养实验已经证实了星形胶质细胞条件培养液（astrocyte-conditionedmedium,ACM）中具有很多神经元需要的物质，起到对神经元的保护作用，出现这种共存的现象说明ACM确实存在着能够加快受损神经元功能的恢复及对受损神经元起到营养支持的作用。虽然星形胶质细胞对神经元的保护作用已被研究者认可，但其对神经元的保护作用机制依然不清，因为机制不清，也为我们进一步研究ACM对受损神经元的营养支持作用的机制提供了机遇。本实验利用培养原代细胞的方法及技术，从而得到星形胶质细胞、神经元，给予特殊处理及干预细胞从而建立模拟脑缺血再灌注损伤模型，如：ACM、ACMa及ACM+a等方法来预处理因缺血缺氧状态受到损伤的神经元；利用倒置显微镜观察镜星形胶质细胞及神经元的形态学变化，流式细胞术检测细胞凋亡结果，XTT法测定细胞活性，利用免疫细胞化学技术及免疫荧光技术分别测定神经元特异性稀醇化酶（neuron–specificenolase，NSE）强阳性细胞的表达量，各组神经元细胞中caspase-3蛋白表达及活性检测，应用Westernblot分析各组神经元caspase-3的活性。从而了解经缺氧/复氧损伤的神经元在星形胶质细胞和Ado的作用下，对它们起到的修复、支持、保护的作用，从而揭示Ado在中枢神经系统受到损害后是发挥作用的途径以及特异的保护机制产生的机理，为Ado应用于临床治疗缺血缺氧性脑血管疾病提供理论支持。目的分析星形胶质细胞与Ado对缺氧/复氧神经元损伤的保护作用，Ado对神经系统的作用方法及特异的保护机制，并进一步探讨Ado预处理后ACM的对受损神经元的营养支持作用，从而为Ado应用在临床缺血缺氧性脑血管疾病的治疗上提供理论依据。材料与方法通过提取SD大鼠大脑皮层的星形胶质细胞、海马区以及大脑皮层的神经元在体外进行培养，进一步纯化后，经处理建立一种类似于脑缺血再灌注损伤的模型，并收集再灌注18h后的ACM和经Ado预处理的再灌注18h的ACMa（ACM+含100μmol/LAdo的DMEM液），然后用ACM、ACMa及ACM+a按1:5的浓度配制培养液，将缺氧/复氧的损伤神经元放置于配置好的培养液中进行培养；然后观察星形胶质细胞、神经元的形态学变化运用倒置显微镜，使用XTT法测法测定星形胶质细胞、神经元活性变化，使用免疫细胞化学技术和免疫荧光技术分别测定胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）、NSE强阳性细胞的表达量，利用ELISA试剂盒进行星形胶质细胞乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）酶联免疫分析，运用流式细胞术检测细胞凋亡，按Promega公司的CaspACETMAssaySystem，Colorimetric试剂盒说明书进行各组神经元caspase-3活性测定，应用Westernblot分析各组神经元caspase-3的活性。结果光镜观察：正常组：神经元折光性好，细胞胞体为椭圆形，生长状态良好，突触之间呈网状结构紧密联系在一起；模型组：神经元折光性变差，细胞的胞体增大且形态不规则，突触明显减少或消失；ACM组、ACM+a组及ACMa组细胞形态介于正常组和模拟组之间，从总体观察结果来说，神经元形态变化的排列顺序：ACMa组＞ACM+a组＞ACM组。流式细胞术检测细胞凋亡结果：与正常组相比，模型组、ACMa组、ACM+a组和ACM组细胞凋亡均显著增加；而ACMa组、ACM+a组和ACM组细胞凋亡显著低于模型组，ACMa组细胞凋亡显著低于ACM+a组和ACM组，ACM+a组和ACM组细胞凋亡无差异。通过XTT检测法检测细胞活性：模型组：神经元活性明显下降，吸光度OD值结果得出模型组较正常对照组明显降低。干预组：ACMa组、ACM+a组及ACM组神经元的活力较模型组均有所提高，根据吸光度OD值，其作用强度ACMa组＞ACM+a组＞ACM组。神经元表达NSE的测定：模型组：神经元表达NSE的能力明显降低，均较ACMa组、ACM+a组及ACM组神经元表达NSE的能力低；对细胞培养片染色后呈阳性的进行图像分析，结果得出：ACMa组＞ACM+a组＞ACM组。caspase-3的活性：ACMa组、ACM+a组及ACM组神经元caspase-3的活性均较模型组下降，其作用：ACMa＞ACM+a＞ACM。caspase-3活性测定结果显示：与模型组相比，ACMa组、ACM+a组和ACM组神经元细胞中Caspase-3活性均显著降低；而ACMa组Caspase-3活性低于ACM+a组和ACM组，ACM+a组和ACM组细胞凋亡结果无差异。结论1、通过检测细胞活性、检测受损神经元中NSE的表达量分析得出ACM对缺氧/复氧损伤的神经元起到保护及修复作用；2、通过检测凋亡神经元、受损伤神经元中caspase-3的活性变化得出ACM能抑制细胞凋亡；3、星形胶质细胞对脑缺血再灌注损伤组织起到保护作用，经腺苷预处理后它对受损神经元的支持、保护、修复作用增强。
【作者】谭军；
【导师】许予明；
【作者基本信息】郑州大学，神经病学（专业学位），2013，博士
【关键词】腺苷；缺氧；复氧；星形胶质细胞条件培养液；星形胶质细胞；神经元；

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